AAT Bioquest 175 Cyanine 5.5 maleimide [equivalent to Cy5.5® maleimide]

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美國AAT Bioquest Inc.(前身是ABD Bioquest，Inc.)是一家為從事生命科學研究、診斷研發及藥物開發的科學家研發、生產和銷售生物分析研究試劑和試劑盒的公司。公司致力于光譜學檢測領域，包括吸收（顏色），熒光和發光技術。AAT Bioquest的產品幫助quan世界的科學家和生物醫藥研究者更好的了解生物化學，免疫學，細胞生物學和分子生物學等領域。AAT Bioquest會不斷介紹新產品，快速的豐富各個領域的產品。

 AAT Bioquest qing化物5.5馬來酰亞胺

AAT Bioquest 175 Cyanine 5.5 maleimide [equivalent to Cy5.5® maleimide]，產品簡介：

產品品牌：AAT Bioquest

產品貨號：175

產品名稱：qing化物5.5馬來酰亞胺[相當于Cy5.5®馬來酰亞胺]

英文名稱：AAT Bioquest 175 Cyanine 5.5 maleimide [equivalent to Cy5.5® maleimide]

產品規格：1 mg

產品說明：

多種花青 5.5 （Cy5.5®） 染料已被用于標記生物分子，用于熒光成像和其他基于熒光的生化分析。它們廣泛用于標記肽、蛋白質和寡核苷酸等。Cy5.5®染料是最常見的紅色熒光團之一。Cy5.5®馬來酰亞胺容易與硫醇基團反應。Cy5.5®是GE Healthcare的商標。

示例協議

儲備溶液的制備

除非另有說明，否則所有未使用的儲備溶液應分成一次性等分試樣，并在制備后儲存在-20°C。避免反復凍融循環。

1.花青5.5馬來酰亞胺儲備液（溶液B）

將無水DMSO加入花青5.5馬來酰亞胺小瓶中，制成10mM儲備溶液。通過移液或渦旋充分混合。注意：在開始偶聯之前制備染料儲備溶液（溶液B）。請及時使用。延長染料儲備溶液的儲存可能會降低染料活性。溶液 B 在避光和防潮的情況下可在冰箱中儲存長達 4 周。避免凍融循環。

2.蛋白質儲備液（溶液A）

將 100 μL 反應緩沖液（例如，pH ~6.0 的 100 mM MES 緩沖液）與 900 μL 目標蛋白溶液（例如抗體、蛋白濃度>如果可能，為 2 mg/mL）混合，得到 1 mL 蛋白標記儲備液。注意：蛋白質溶液（溶液A）的pH值應為6.5±0.5。注意：不純的抗體或用牛血清白蛋白 （BSA） 或其他蛋白質穩定的抗體將不能很好地標記。注意：如果蛋白質濃度低于 2 mg/mL，則偶聯效率顯著降低。為獲得最佳標記效率，建議最終蛋白濃度范圍為 2-10 mg/mL。

3. 可選

如果您的蛋白質不含游離半胱an酸，則必須用 DTT 或 TCEP 處理您的蛋白質以生成硫醇基團。DTT 或 TCEP 用于將二硫鍵轉化為兩個游離硫醇基團。如果使用 DTT，則必須在將染料馬來酰亞胺與蛋白質偶聯之前，通過透析或凝膠過濾去除游離 DTT。以下是生成游離硫醇基團的示例方案：

1. 在蒸餾水中制備1M DTT（15.4mg / 100μL）的新鮮溶液。

2. 在 20 mM DTT 中制備 IgG 溶液：混合時每 ml IgG 溶液中加入 20 μL DTT 原液。在室溫下靜置 30 分鐘，無需額外混合（以盡量減少半胱an酸再氧化為胱an酸）。

3. 將還原的IgG通過用“交換緩沖液"預先平衡的過濾柱。從色譜柱上收集 0.25 mL 餾分。

4. 確定蛋白質濃度并將餾分與大部分 IgG 合并。這可以通過分光光度法或比色法完成。

5. 在此步驟之后盡快進行偶聯（參見樣品實驗方案）。注意：IgG 溶液應為 >4 mg/mL，以獲得最佳效果。如果抗體低于 2 mg/mL，則應濃縮抗體。在緩沖液交換柱上額外增加 10% 的損失。注意：還原可以在pH 7-7.5的幾乎任何緩沖液中進行，例如MES、磷酸鹽或TRIS緩沖液。注意：步驟 3 和 4 可以用透析代替。

實驗方案樣本

該標記方案是為山羊抗小鼠 IgG 與花青 5.5 馬來酰亞胺的偶聯物而開發的。您可能需要針對您的特定蛋白質進行進一步優化。注意：每種蛋白質都需要不同的染料/蛋白質比例，這也取決于染料的性質。蛋白質的過度標記可能會對其結合親和力產生不利影響，而染料/蛋白質比率低的蛋白質偶聯物會降低靈敏度。

運行偶聯反應

以溶液B（染料）/溶液A（蛋白質）的摩爾比為10：1的摩爾比作為起點：將5μL染料儲備溶液（溶液B，假設染料儲備溶液為10mM）加入蛋白質溶液（95μL溶液A）的小瓶中，有效搖動。假設蛋白質濃度為 10 mg/mL，蛋白質的分子量為 ~200KD，則蛋白質的濃度為 ~0.05 mM。 注意：我們建議使用溶液 B（染料）/溶液 A（蛋白質）的摩爾比為 10：1。如果太少或太高，則分別確定 5：1、15：1 和 20：1 的最佳染料/蛋白質比例。

在室溫下繼續旋轉或搖動反應混合物30-60分鐘。

純化偶聯物

以下方案是使用Sephadex G-25色譜柱進行染料-蛋白偶聯純化的示例。

根據制造說明制備Sephadex G-25色譜柱。

將反應混合物（來自“運行共軛反應"）加載到 Sephadex G-25 色譜柱的頂部。

一旦樣品在頂部樹脂表面下方運行，立即加入 PBS （pH 7.2-7.4）。

向所需樣品中加入更多的PBS（pH 7.2-7.4）以完成色譜柱純化。合并含有所需染料-蛋白質偶聯物的餾分。注意：為了立即使用，染料-蛋白質偶聯物需要用染色緩沖液稀釋，并等分用于多種用途。注意：為了長期儲存，染料-蛋白質偶聯物溶液需要濃縮或冷凍干燥。

  AAT Bioquest qing化物5.5馬來酰亞胺

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